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Nature Microbiology volume 7, páginas 2128–2150 (2022)Cite este artigo

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Apesar dos avanços no sequenciamento, a falta de padronização torna as comparações entre estudos desafiadoras e dificulta a compreensão da estrutura e função das comunidades microbianas em vários habitats em escala planetária. Aqui apresentamos uma análise multiômica de um conjunto diversificado de 880 amostras de comunidades microbianas coletadas para o Projeto Microbioma da Terra. Incluímos dados de sequência metagenômica de amplicon (16S, 18S, ITS) e shotgun, e dados metabolômicos não direcionados (cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem e espectrometria de massa por cromatografia gasosa). Utilizamos protocolos padronizados e métodos analíticos para caracterizar comunidades microbianas, com foco nas relações e co-ocorrências de metabólitos microbianamente relacionados e táxons microbianos em todos os ambientes, permitindo-nos explorar a diversidade em escala extraordinária. Além de um banco de dados de referência para dados metagenômicos e metabolômicos, fornecemos uma estrutura para incorporar estudos adicionais, permitindo a expansão do conhecimento existente na forma de um recurso comunitário em evolução. Demonstramos a utilidade deste banco de dados testando a hipótese de que cada micróbio e metabólito está em toda parte, exceto o ambiente seleciona. Nossos resultados mostram que a diversidade de metabólitos exibe rotatividade e aninhamento relacionados às comunidades microbianas e ao meio ambiente, enquanto as abundâncias relativas de metabólitos microbianamente relacionados variam e co-ocorrem com consórcios microbianos específicos de uma maneira específica do habitat. Além disso, mostramos o poder de certos produtos químicos, em particular dos terpenóides, na distinção dos ambientes da Terra (por exemplo, superfícies e solos de plantas terrestres, fezes de animais de água doce e marinhos), bem como de certos micróbios, incluindo Conexibacter woesei (solos terrestres), Haloquadratum walsbyi (depósitos marinhos) e Pantoea dispersa (detritos de plantas terrestres). Este recurso fornece informações sobre os táxons e metabólitos dentro das comunidades microbianas de diversos habitats em toda a Terra, informando a ecologia microbiana e química, e fornece uma base e métodos para estudos de microbiomas multiômicos de hospedeiros e do meio ambiente.

Um dos principais objetivos da ecologia microbiana é compreender a estrutura das comunidades microbianas, como isso está relacionado com a composição taxonômica, filogenética e funcional microbiana, e como essas relações variam no espaço e no tempo. Como um único estudo não é capaz de amostrar todos os ambientes repetidamente para permitir tais inferências, é de extrema importância promover o uso de métodos padronizados que permitam meta-análises em estudos distintos1,2,3,4. Os esforços iniciais focados em protocolos padronizados para sequenciamento de RNA ribossômico 16S (rRNA) de comunidades bacterianas/arqueais forneceram informações sobre como as comunidades se estruturam no ambiente, apoiando fortes eixos de separação de micróbios ao longo de gradientes de associação de hospedeiros e salinidade . Esforços mais recentes focados em dados metagenômicos shotgun6,7,8,9 começaram a fornecer informações adicionais sobre o potencial funcional em todos os ambientes10,11,12,13,14, e os métodos atuais de última geração empregam abordagens multi-ômicas incluindo metagenômica, transcriptômica, proteômica e/ou metabolômica15,16,17,18,19,20,21,22,23,24.

Os micróbios produzem diversos metabólitos secundários que desempenham funções vitais, desde a comunicação até a defesa25,26,27 e podem beneficiar a saúde humana e a sustentabilidade ambiental28,29,30,31,32,33,34. Embora a mineração de metagenoma e a transcriptômica sejam formas poderosas de caracterizar a função em comunidades microbianas10,14,24, uma abordagem mais poderosa para compreender a diversidade funcional é gerar evidências químicas que confirmem a presença de metabólitos19,20,21 e descrevam com precisão sua distribuição pela Terra. Aqui apresentamos uma abordagem que avalia diretamente a presença e abundância relativa de metabólitos e fornece uma descrição precisa dos perfis de metabólitos em comunidades microbianas em todos os ambientes da Terra. Embora vários estudos tenham empregado anteriormente metagenômica e metabolômica em conjunto22,23,35,36,37,38,39,40, muitos empregaram métodos técnicos relativamente limitados ou traçaram o perfil de um número relativamente pequeno de classes de metabólitos23,35,40, impedindo a comparação entre estudos isso poderia expandir nossa compreensão. Além disso, vários estudos anteriores estão limitados em escopo a um único ambiente ou habitat20,23,24,35,36,37,38,39. Nosso trabalho vai substancialmente além do que foi relatado anteriormente em relação à análise multiômica de comunidades microbianas usando metagenômica e metabolômica, ao incluir múltiplos ecossistemas. A abordagem que aplicamos complementa a metagenômica com um levantamento direto de metabólitos secundários usando metabolômica não direcionada.

1.5–2 kb DNA fragments’ (Oxford Nanopore Technologies). The resulting product consists of uniquely tagged rRNA operon amplicons. The uniquely tagged rRNA operons were amplified in a second PCR, where the reaction (100 µl) contained 2 U Platinum SuperFi DNA Polymerase High Fidelity (Thermo Fisher) and a final concentration of 1X SuperFi buffer, 0.2 mM of each dNTP, and 500 nM of each forward and reverse synthetic primer targeting the tailed primers from above. The PCR cycling parameters consisted of an initial denaturation (3 min at 95 °C) and then 25–35 cycles of denaturation (15 s at 95 °C), annealing (30 s at 60 °C) and extension (6 min at 72 °C), followed by final extension (5 min at 72 °C). The PCR product was purified using the custom bead purification protocol above. Batches of 25 amplicon libraries were barcoded and sent for PacBio Sequel II library preparation and sequencing (Sequel II SMRT Cell 8M and 30 h collection time) at the DNA Sequencing Center at Brigham Young University. Circular consensus sequencing (CCS) reads were generated using CCS v.3.4.1 (https://github.com/PacificBiosciences/ccs) using default settings. UMI consensus sequences were generated using the longread_umi pipeline (https://github.com/SorenKarst/longread_umi) with the following command: longread_umi pacbio_pipeline -d ccs_reads.fq -o out_dir -m 3500 -M 6000 -s 60 -e 60 -f CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT -F AGRGTTYGATYMTGGCTCAG -r AATGATACGGCGACCACCGAGATC -R CGACATCGAGGTGCCAAAC -U ‘0.75;1.5;2;0’ -c 2./p>{sample_identifier}_{sequence_identifier}’), concatenated into a single fasta file and imported. We then used QIIME 2’s ‘vsearch’ plugin132 to dereplicate sequences and then cluster them at 65% similarity (that is, due to rapid evolution at bacterial ITS regions). The 65% OTU feature-table had 365 samples and 285 features. The concatenated fasta file and 65% OTU feature-table were uploaded to Qiita as distinct preparations (study: 13114). We then used QIIME 2’s90 ‘feature-table’ plugin to exclude singleton OTUs and samples with a total frequency of <500 reads, and the ‘deicode’91 plugin to estimate beta-diversity for each dataset using robust Aitchison distances91. The final feature-table for full-length rRNA operon beta-diversity analysis included 242 samples and 196 features./p>90)./p>